Honing, het tibioticum van de toekomst?

De antibacteriële werking van honing

Leerlingen: Gaëlle Boisset en Marlieke Elsendoorn
Docent: Jan Brinkhuis
School: Christelijk Lyceum Veenendaal

Inleiding

Antibiotica zijn een groep stoffen van organische oorsprong die worden gemaakt door schimmels om bacteriële infecties van de schimmel en tegenwoordig ook van de mens, te bestrijden. Antibiotica zijn te verdelen in twee groepen: de bacteriostatische (bacterieremmende) en de bactericide (de bacteriedodende) antibiotica. De bacteriostatische antibiotica zorgen tijdelijk voor de remming van de bacteriegroei en –deling, zodat ons immuunsysteem de tijd krijgt om te herstellen en uiteindelijk zelf de bacteriën zal opruimen. De bactericiden beschadigen de bacteriën dusdanig dat deze vanzelf doodgaan. De ontdekking van antibiotica heeft ertoe geleidt dat bacteriën effectief bestreden kunnen worden. Elke schimmelsoort heeft zijn eigen tactiek om bacteriën aan te vallen en uit de weg te ruimen, waardoor veel verschillende soorten antibiotica bestaan. Ze verstoren specifieke en levensbelangrijke processen en hebben het hierbij vaak gemunt op de celwand van de eencellige micro-organismen, omdat dit hen beschermt tegen invloeden van buiten. De werking van antibiotica brengt ook een probleem met zich mee. Bacteriën kunnen namelijk bestand worden tegen een bepaald antibioticum; na toediening van een antibioticum treedt er een verminderende of in het geheel geen reactie op. Dit wordt resistentie genoemd. In dit onderzoek zullen wij gaan werken met het antibioticum ampicilline. Het is een semi- synthetisch breed-spectrum penicilline dat wil zeggen dat het de celwandsynthese bij veel soorten bacteriën remt. Het heeft een bactericide werking tegen zowel grampositieve als gramnegatieve bacteriën.

Figuur 1 Honing

Vraagstelling

In welke mate heeft honing een antibacteriële werking ten opzichte van ampicilline?

Hypothese

Als honing een betere antibacteriële werking heeft dan ampicilline, dan zal een verminderde bacteriegroei te meten zijn. Om dit te toetsen is de antibacteriële werking van honing in verschillende verdunningen vergeleken met die van ampicilline.

Theorie

Wij kennen honing als zoete lekkernij, maar daarnaast staat het tegenwoordig ook bekend om zijn medicinale werking. In het menselijk lichaam wordt honing te snel afgebroken om zijn werk te kunnen doen, maar het zou wel soelaas kunnen bieden op de huid. Denk noindent daarbij aan huidinfecties, schaafwonden en brand wonden. Honing bevat een hoge concentratie suiker. Van de monosachariden fructose en glucose tot de disachariden maltose, sacharose en turanose. Al deze suikers werken mee aan een antibacteriële werking.

De samenstelling van honing
Water	17 %
Suikers Fructose Glucose Maltose Sacharose Andere suikers	79,5 % 38 % 31 % 7,5 % 1,5 % 1,5 %
Overige stoffen	3,5 %

Door de hoge suiker concentratie werkt de honing osmotisch, waardoor het water onttrekt uit zijn omgeving. Het water wordt zo ook onttrokken aan bacteriecellen, met als gevolg dat de celmembraan zal loslaten van de celwand (plasmolyse) en vervolgens zal breken (lysis). De bacteriecel zal afsterven. In een gidsexperiment hebben we onderzocht of honing inderdaad bacteriedodend werkt. Er is een stamoplossing met dezelfde hoeveelheden en soorten suiker als in honing gemaakt. Hiervan is een concentratiereeks gemaakt en vervolgens in iedere oplossing 50μl E. coli toegevoegd. Nadat de bacteriën onder optimale omstandigheden gedurende 24 uur konden groeien, zijn de concentraties bacteriën gemeten met behulp van een OD-meter.

Figuur 2 Verband tussen de concetratie van suiker en bacteriegroei

We zien dat bij een suikerconcentratie van 640 g/L al dodelijk is voor E.coli K12. Uit dit onderzoek kunnen wij concluderen dat suiker bij hogere concentraties bacterieremmend werkt.

Bij 30% suikers zie je al een effect op E.coli. de groei stopt bij 80% suikers.

Materiaal en methode

Om te onderzoeken in welke mate honing antibacterieel werkt, zal het vergeleken worden met antibiotica. Hierin dient de laatste als een gouden standaard waarmee het effect van de honing vergeleken kan worden.

Voor dit onderzoek wordt de bacterie Escherichia coli gebruikt, kortweg E. coli. Dit is een gramnegatieve bacterie die heel algemeen voorkomt in de darmen, waar hij meehelpt met de vertering, maar ook vitamine K produceert. De labvariant, E. coli K12, wordt gebruikt als modelorganisme in veel onderzoeken. Het eenvoudige genoom is volledig in kaart gebracht en het is een goed te kweken (delingstijd rond de twintig minuten) en ongevaarlijke bacterie. Dit zijn ook de redenen dat deze bacterie is gekozen voor dit onderzoek. Hoewel hij niet op de huid voorkomt en daarmee nooit in aanraking met medicinale honing kan komen, zijn veel huidbacteriën te moeilijk en te gevaarlijk om mee te werken. Daarnaast zijn de antibacteriële stoffen in honing vrij aspecifiek en zullen wij een breed spectrum antibioticum gebruiken, waardoor de keuze voor deze bacterie gerechtvaardigd is.

In dit onderzoek zal er met concentratiereeksen gewerkt worden. Er zullen bacteriën opgekweekt worden waarna de remming van de groei bepaald wordt. Dit zal gebeuren in vloeibaar medium. We kiezen voor LB medium. LB staat voor ‘Luria Broth’ en bestaat uit demiwater met een aantal toegevoegde voedingsstoffen. Bacteriën groeien goed in deze oplossing en daarom wordt het vaak voor deze doeleinden gebruikt. Eén liter LB medium heeft de volgende samenstelling: 1 liter demiwater met daarin opgelost 10 gram tryptoon, 5 gram gist extract en 10 gram Natriumchloride. Voor de oplossing gebruikt kan worden, moet deze eerst geautoclaveerd worden. Door de oplossing twintig minuten bij een temperatuur van 120°C te verhitten zijn alle bacteriën gedood en is de oplossing steriel. Om te meten hoeveel bacteriën er in het LB medium zijn gegroeid, wordt een OD-meter (Optical Density) gebruikt. Je zet een klein buisje met de oplossing in de meter. Vervolgens wordt er licht doorheen geschenen en wordt er aan de andere kant gemeten hoeveel licht er over is gebleven. De hoeveelheid licht die door de oplossing is geabsorbeerd, is een maat voor de concentratie bacteriën in de oplossing. De meter geeft een waarde van de absorptie in abs bij een golflengte van 600 nm, dit is de golflengte waarop het apparaat de absorptie meet. De bacteriegroei wordt niet gemeten in een echte eenheid, maar is een relatieve maat van de bacteriegroei ten opzichte van de controle. Er moet altijd een ‘nul’ zijn ingesteld, dit is een oplossing zonder bacteriën, waar de andere waarden tegen af worden gezet. Hoe meer bacteriën in een oplossing, hoe hoger de absorptiewaarde.

Door middel van een aantal concentratiereeksen zal gekeken worden naar het antibacteriële effect van:

• 80% suikeroplossing in water
• Honing (raathoning en uit een potje)
• Ampicilline
• Ampicilline in 80% suikeroplossing

Resultaten

Figuur 3 De bacteriegroei in oplossingsreeksen van de verschillende antibacteriële stoffen

Wat in ons pilotonderzoek al aangetoond was en tijdens dit onderzoek wederom bevestigd, is dat suiker antibacterieel werkt. Honing bevat deze suikers en dit zou zijn antibacteriële werking al kunnen verklaren. Als de trendlijn van de suikeroplossing vergelijken wordt met die van de honing is echter te zien dat honing een sterker antibacterieel effect heeft dan suiker, waarbij honing uit potje het nog beter doet dan honing uit was. Dit betekent dat er in honing, naast de suikers, daadwerkelijk andere stoffen zitten met een antibacteriële werking.

Zoals te verwachten is werkt een steeds hogere concentratie ampicilinne steeds meer remmend op de groei van E. coli. Het effect van ampicilinne is duidelijk beter dan van een suikeroplossing. Een combinatie van ampicilinne en een suikeroplossing doet het niet beter dan alleen ampicilinne. Opmerkelijk geeft honing (zowel uit de raat als uit een potje) een beter antibacterieel effect dan ampicilinne.

Omdat zowel de positieve als negatieve controle groepen de door ons verwachtte resultaten lieten zien, mogen we ervan uit gaan dat de resultaten betrouwbaar zijn.

Conclusie

Onze hypothese was dat honing wel antibacterieel werkt, maar minder effectief dan ampicilline.

De suikeroplossing met antibioticum geeft een sterkere groeiremming dan het antibioticum alleen. Dit wijst erop dat de suikers ook bijdragen tot meer groeiremming.

Uit de resultaten blijkt ook dat honing een sterkere antibacteriële werking lijkt te hebben dan een oplossing met daarin vergelijkbare concentraties suikers als in honing. Dit wijst erop dat er nog extra stoffen in honing zitten die bijdragen aan een remming van bacteriegroei.

Uit de resultaten blijkt ook dat we onze hypothese niet kunnen bevestigen. Honing heeft in onze experimenten een sterkere antibacteriële werking dan ampicilline.

Discussie

Tijdens ons onderzoek is niet alles perfect verlopen, vandaar de onderstaande discussieen eventuele verbeterpunten.

• Uit de resultaten blijkt dat honing een sterkere antibacteriële werking heeft dan antibiotica en zelfs sterker dan suiker en antibiotica gecombineerd. Waar dit door komt is niet met zekerheid te zeggen. Wij vermoeden dat de antibacteriële stoffen samen met de suikers een samengesteld effect krijgen, wat de werking versterkt. Om dit verder uit te zoeken zou vervolgonderzoek nodig zijn.
• Uit de resultaten blijkt ook dat raathoning een sterkere antibacteriële werking heeft dan honing uit een potje. Hoewel de trendlijn van de honing uit een potje (aan het begin) steiler loopt dan die van de raathoning, blijft de tweede veel resoluter op de nul zitten. Hoewel dit niet met zekerheid te zeggen valt, verwachten we dat dit kwam door de lichtelijke bewerking van de honing uit het potje.
• Tijdens het maken van de concentratiereeksen hebben we honing in de buizen gepipetteerd. Omdat de honing stroperig is en erg plakt is dit heel moeilijk. We hebben de pipetpunt groter gemaakt (door er een deel af te knippen) en ook negatief gepipetteerd om het gemakkelijker te maken. Maar het is heel goed mogelijk dat hiermee fouten in de hoeveelheden zijn gemaakt.
• We hebben geen enkele stof door een bacteriefilter gehaald (omdat dit met de honing niet kon), dus de stoffen waren niet steriel. Er is een controle ingebouwd (elk laatste buisje van de concentratiereeks -2), maar toch kunnen we niet met zekerheid zeggen dat dit geen (kleine) invloed heeft gehad op de onze resultaten.
• We hebben voor ons onderzoek honing van raat en honing uit een potje gebruikt. Deze soorten honing kwamen uit twee verschillende jaren (respectievelijk 2014 en 2013). Dit maakt dat de samenstelling iets veranderd kan zijn, wat het kleine verschil in bacterie groeiremming zou kunnen verklaren.
• Tijdens het meten van de absorptiewaarden kwamen wij erachter dat de OD-meter een maximum van 2,0 abs had, een hogere waarde was niet meetbaar. We hadden enkele keren waarschijnlijk wel te maken met een waarde hoger dan 2,0 abs, die we niet mee hebben kunnen nemen in ons onderzoek. Deze onbekende waarde is ook de reden geweest dat we in de grafiek ‘Verband tussen concentratie antibiotica en bacteriegroei’ het allereerste punt niet meegenomen hebben. We hebben hiervoor gekozen omdat wij niet over de techniek beschikken om een grafiek wél conform de meetwaarden te laten lopen. De grafieken van de reeksen met antibiotica en suiker met antibiotica vertoonden tussen de eerste twee meetpunten een bergje, wat niet klopte. Dat bergje was een aanname van Excel dat niet ondersteund werd door de resultaten, waardoor we gekozen hebben dit niet weer te geven.
• We kunnen niet uitsluiten dat de pH van de oplossingen een rol heeft gespeeld in de antibacteriële werking ervan, de pH is tijdens het onderzoek namelijk niet gemeten. Honing heeft een lage pH (ongeveer 4), wat bijdraagt aan de antibacteriële werking. Als de honing verdund wordt met wondvocht, zal de pH stijgen. Een hogere pH resulteert in een vermindering van de antibacteriële werking op dit gebied. Omdat onze honing verdund is in LB medium zonder buffer, zal de pH hierbij ook gestegen kunnen zijn. We weten niet óf er een verschil in de pH is geweest en in het geval dat het er wel was of het de meetresultaten heeft beïnvloed. In een vervolgonderzoek is het goed om rekening te houden met de pH van de oplossingen en deze gelijk te houden aan de pH van honing op een wond.